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像核酸純化一樣快速高效、穩健低成本的蛋白質組學樣品制備技術
[ 發布日期:2024-6-14 8:55:32    閱讀次數:23 ]

特拉華大學化學與生物化學系蛋白質組學主任Yanbao Yu開發了一種用于蛋白質組學分析的蛋白質樣品制備的簡化方法,該方法快速、易于使用、價格低廉,并且普遍兼容現有蛋白質分析流程。Yu和他的合作者在6月11日發表在《 Cell Reports Methods》雜志上的一篇論文中報告了這種正在申請專利的方法的有效性。

 

了解細胞中蛋白質的數量或組成可以幫助研究人員了解在特定時間甚至一段時間內我們體內發生的事情。例如,某些蛋白質的存在或缺失可以作為一個人的生物學指標。一旦樣本經過制備純化,蛋白質組學科學家們可使用高靈敏度的質譜儀來確定特定蛋白質的身份。蛋白質樣本制備通常需要處理血液、組織或其他生物材料的樣本,使其可通過質譜法分析,這是關鍵。當前蛋白質組學分析在很大程度上受到缺乏一種通用樣品制備方法的阻礙,這就是Yu的工作發揮作用的地方。

方法簡單,效果好

Yu的方法以一種高效、有效和經濟的方式簡化了樣品的制備,他稱之為E3。他通過UD的經濟創新與伙伴關系辦公室(OEIP)正在申請專利。CDS公司是蛋白質組學樣品制備耗材和儀器的領先供應商,擁有正在申請專利的UD技術的完全商業權利的獨家許可。該方法將惰性玻璃微珠(GB)與CDS Analytical公司的Empore膜相結合,構建了一種性能強大的GB固定膜,可以集成到多種樣品采集設備——如過濾器、移液器、卡盒(cartridges)或平板,提供了一個簡單易用、成本更低的蛋白質組學樣品制備平臺。

他們將二氧化硅微珠固定到聚四氟乙烯基質中以構建一種強大的膜介質,能夠以快速和低成本的方式,可靠地生成適用于蛋白質組學分析的樣品。作者使用不同的形式對其性能進行基準測試,并使用不同復雜性、數量和體積的各種樣本類型進行測示,結果表明這種e3技術可提供相當于或優于許多現有方法的蛋白質組鑒定和定量性能。作者進一步提出了一種增強的單管e4技術,可以以最小的樣品損失和高靈敏度進行細胞內過濾消化,實現低輸入和低細胞蛋白質組學。最后,作者利用上述技術制備RNA結合蛋白,并繪制了完整的細菌細胞蛋白質組。

技術指標

典型蛋白質組學分析的最終目標是分析生物樣本的所有蛋白質——蛋白質組,以便揭示與生物學和/或病理學相關的分子和標記蛋白,尤其是那些豐度較低的分子和標記蛋白。因此,自下而上/散彈槍蛋白質組學實驗的主要組成部分是樣品制備,包括細胞裂解和蛋白質提取、清理和消化以及肽脫鹽。高效細胞裂解是實現高產無偏蛋白質提取的關鍵。蛋白質完全變性后的消化,既可以在溶液中進行,也可以在固體載體上進行。

固定化色譜珠在聚四氟乙烯(PTFE)網被廣泛地稱為Empore膜。Empore 膜比游離珠粒具有很大的優勢。這是因為松散的顆粒被困在 PTFE 基質中,使它們更容易操作(例如分裝、轉移等)。由于 Empore 膜可以方便地裝入單個過濾裝置或多孔板中,因此基于膜的樣品制備很容易擴展和自動化,無需進行大量的方法調整或重新優化?;谝陨蟽瀯?,作者首次將 Empore 技術與 GB 結合起來,構建了固定化 GB 膜。他們測試過兩種不同尺寸的 GB,一種在 10 μm 范圍內,另一種在 30 μm 左右。對 GB 膜的初步檢查顯示,珠子被固定在適當位置并嵌入 PTFE 網中。初步消化實驗表明,兩種 GB 膜具有同等的識別性能。研究后續使用 30 μm GB 膜。

各種樣本測試

首先制備分析大腸桿菌蛋白質組以評估 GB 膜的定性和定量蛋白質組學性能。將膜組裝到0.5 mL 過濾裝置中來構建原型 E3過濾柱。三個獨立的消化實驗,輸入約 20 μg大腸桿菌裂解物并進行單次液相色譜-質譜 (LCMS) 運行,E3 filter 平均能夠識別 2,207 種蛋白質和 17,358 種肽,這些結果始終高于同樣在此測試的現有的 FASP 和 SP4-GB 方法。E3technology 具有出色的定量可重復性,E3filter 還比其他兩種方法定量了更多的蛋白質。E3filter 定量的大腸桿菌蛋白質組圖譜與 FASP 的聚類程度比 SP4-GB 的聚類程度更高。

然后制備分析HEK293細胞蛋白質組,并將其與最近報道的另一種過濾輔助方法(通過簡便的提取和消化進行過濾輔助樣品制備,FA-SPEED)進行了對比。實驗數據表明,從20 μg蛋白質輸入中,E3tips可以分別識別超過5,200和39,000個非冗余蛋白質組和肽段,以及近86,000個肽段特征。這些數字在重復實驗中具有很高的可重復性,該方法的定量可重復性也很好。兩種方法之間的定量相關性始終較高,蛋白質平均為 0.97,多肽平均為 0.93。這些數據表明兩種膜類型之間具有很高的相似性。

接著制備分析小鼠腎臟組織樣本的蛋白質組,組織樣本往往具有較寬的動態范圍和較高的復雜性。將E3tips與STrap tip(S-tip)方法進行了比較。數據表明,在三次重復實驗中,E3tip 在蛋白質和肽鑒定方面超過了 S-tip。此外,近 90% 和 80% 的命中結果通過這兩種方法相互識別。E3tip 內部或兩種方法之間的定量相關性也很高。這些數據表明 E3tip 具有很高的可重復性,并且與 S-Tip 方法具有很大的相似性。

再接著,作者將 GB 膜鑄入深孔 96 孔濾板中并處理人類唾液樣本,以探究其在臨床蛋白質組學分析中的潛力。平均而言,可以從五個孔中分別鑒定出 1,400 種蛋白質,幾乎是之前研究報告的蛋白質數量的兩倍。在五個孔中至少有三個檢測到了超過 85% 的唾液蛋白,表明孔之間的差異很小。E3 plate 的成功實施為其自動化提供了明確的證據,而現有 SP4 等基于離心的方法無法實現自動化。研究表明E3可處理了體積多達1mL 的唾液樣本,結果對唾液蛋白質組分析的覆蓋率相當好。

對于微量樣本,作者組裝了E3 tip 作為代表性方法,因為它的接觸面和處理量相對較小。數據顯示,從 1 μg 輸入的整個 HEK293 細胞裂解物來看,E3tip 的表現優于 S-tip,能夠鑒定超過 3,700 種獨特蛋白質和 20,000 種肽,與使用相同量裂解物輸入的 SP3 和 in-StageTip (iST) 方法的鑒定輸出相似。

再接著, 作者探究了E3technology 單管完成完整的樣品制備的可能性。利用 Empore 技術創建了多功能 GB|C18 膜—— C18 增強型E4 技術進行低細胞分析。在這個實驗中,細胞用甲醇固定在 E4 過濾器上,然后直接進行過濾器內細胞 (OFIC) 消化。之后,所得肽通過具有 C18 功能的 E4 過濾器方便地脫鹽,從而在凍干后得到可用于 LCMS 的樣品。由于不涉及細胞裂解,并且所有處理步驟都在同一設備中進行,因此這種 OFIC 方法應最大限度地減少樣品損失。從大約 25,000 個 Jurkat 細胞開始,平均能夠識別超過 4,300 種蛋白質和近 30,000 種肽。相比之下,當同樣數量的細胞首先用 SDS 緩沖液裂解,然后使用上面建立的 E3 程序進行消化時,鑒定出的蛋白質減少了 20%,肽含量減少了 50%。這些數據表明傳統的“細胞裂解-蛋白質消化”方法會導致大量樣品損失,這對低負荷蛋白質組學分析是不利的。

回答關鍵的生物學問題

UD分子生物學家Mona Batish研究RNA的生物學,RNA是由我們體內的DNA制造的單鏈核糖核酸分子。Batish使用Yu的方法鑒定了RNA結合蛋白(RBP), RBP與我們細胞中發現的一種稱為環狀RNA的非編碼RNA相互作用。環狀RNA可以在體內存在很長一段時間,它們可以調節基因表達,作為腫瘤抑制因子,并引起對化療等藥物的耐藥性或易感性。

Batish說,rbp是許多細胞過程的關鍵,最終有助于確定RNA分子在細胞中的定位和功能。她想更好地了解環狀RNA如何與rbp結合,這對于充分了解環狀RNA作為生物標志物或疾病治療靶點的潛在用途至關重要。

Batish說:“尋找RNA 結合蛋白是很繁瑣的,尤其是當它們的豐度很低的時候,但是Yu的技術幫助我們克服了這個問題,給了我們很好的目標數據。”“它也非??蓮椭?,這是我們談論任何新的生物學發現時最大的因素。與我們過去所做的相比,我們發現這種新技術在樣品中的一致性非常好。”

對數量有限的環境樣品有效

特拉華大學地質學家Clara Chan和她實驗室的副科學家Jessica Keffer研究產生鐵銹的氧化鐵細菌,這種細菌是具有許多重要環境功能的礦物質。這些鐵氧化細菌存在于土壤、濕地、水處理系統、海灘沉積物,甚至是海底。研究人員想要了解這些鐵氧化細菌使用什么蛋白質來形成鐵銹礦物質,但這些生物很難培養和分析。

Chan實驗室進行的一項早期蛋白質組學研究檢測到的蛋白質很少,因此數據有限。Keffer之前用一種去垢劑將它們裂解,釋放出里面的蛋白質和其他物質,如果細胞沒有正常破裂,或者如果去垢劑對它們試圖恢復的蛋白質影響不佳,這種方法可能會導致樣品損失。使用離心機通過高速旋轉來收集細胞也不是一種選擇。這是一個常見的問題。無論研究人員使用的是生物樣本還是環境樣本,最大限度地減少難以獲得的樣本的損失都是一個關鍵挑戰。“蛋白質很容易吸附或粘在塑料上。因此,更多的移液和轉移液體意味著更多的樣品損失。”“理想情況下,你希望在單個設備中以小體積處理如此珍貴的樣品。”

為了解決Keffer的這個問題,Yu建議跳過細胞裂解步驟,而是使用他的團隊技術平臺的增強版本直接在細胞內進行反應和處理。使用E4,Keffer能夠從比她以前使用過的更小的樣品體積中恢復大量的肽和蛋白質。這是一個很有前途的進展,因為這意味著在未來的研究中,她不需要為了獲得高質量的數據而培養大量的細胞。

“在我目前使用的數據集中,我們從我們的生物體中檢測到大約78%的預測蛋白質。這比我們在之前的任何嘗試中看到的蛋白質都要多,”Keffer說。“數據質量也非常高。當我們重復這些研究時,數據非常相似,這很重要,這樣我們就可以對我們所看到的充滿信心。”

這種類型的信息有可能告訴研究人員其他生物是否有這種產生鐵銹的能力,或者導致利用這些蛋白質來創造所需的環境變化或制造新材料的技術。Chan稱這個新技術平臺很有前景:“能夠檢測到蛋白質和蛋白質的實際含量,有助于我們得出它們在做什么的結論。”“如果我們能在生長不太好的文化中做到這一點,也許我們可以進入環境,比目前的環境蛋白質組學能告訴我們的更全面地了解正在發生的事情。”

作者視角

 

“這確實是一種易于使用的技術。”“你不需要博士學位才能有足夠的信心做蛋白質組學。我們已經使這種方法非常強大和可靠,所以每個實驗室科學家都可以做高質量的蛋白質制備。”用于制備這類生物樣品的產品通常都很昂貴。其中一個目標是使其比目前市場上可用的更便宜,使蛋白質組學實驗的價格更接近基因組學實驗的成本,從而對精準醫療和衛生保健成本產生重大影響。“如果我們現在可以降低必要的化學試劑和耗材的成本,那么如果這些測試可以用質譜法完成,那么未來所有患者都可以受益。”總體數據表明,UD開發的方法和由此產生的技術平臺相當或優于現有方法。

“我們很高興有機會將特拉華大學的這項革命性技術商業化,用于蛋白質組學消化和相關步驟,以解決蛋白質組學樣品制備的瓶頸,”CDS分析部門經理說。“結合CDS Analytical Empore line的StageTips技術和MiniLab 5000液體處理機,我們的目標是建立從細胞到LC-MS的蛋白質組學樣品制備的一站式解決方案,以幫助提高蛋白質組學分析的效率和節省成本,并使科學家能夠更有效地探索和了解生物系統。我們很高興為這項革命性的蛋白質組學技術做出貢獻,旨在加速人類生物學深層機制的科學突破,以解決患者未滿足的醫療需求。”

Yu在這項工作中的下一步工作包括將這項技術應用于更多的生物系統,并回答與人類健康更相關的問題,如病毒感染和癌癥。在未來,Yu希望看到這些產品被蛋白質組學社區的研究人員采用和使用,并可能作為一種簡單和一致的方式被臨床醫生用于日常診斷和篩查。


(文章來源:www.ebiotrade.com/newsf/2024-6/20240613064736151.htm

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