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數字PCR技術（digital polymerase chain reaction，dRCR）有別于實時熒光定量PCR技術（Real-time Quantitative PCR，qPCR）。dRCR是第三代PCR技術，無需標準曲線，即可對不同生物樣本類型中獲得的DNA/RNA進行更精確、更靈敏的絕對定量檢測。

dRCR的原理及流程比較簡單，以目前主流的納米微孔芯片式dRCR儀為例：

1.配液：加入引物、探針、模板、Master Mix、水配制PCR反應體系；

2.分區：將PCR反應體系加入納米微孔芯片，芯片通常有20000個以上的納米微孔，反應體系分配到各個納米微孔之中，形成獨立的反應單元；

3.擴增：隨機分配的目標DNA/RNA分子在每個納米微孔中進行單獨、平行的PCR反應；

5.計算：理論上，樣本充分稀釋時，每個納米微孔包含少于或等于一個拷貝的目標DNA/RNA分子。但實際上，部分納米微孔可能含有多個DNA/RNA分子，因此在計數陰性、陽性納米微孔后，需要應用泊松分布進行校正，才能得到目標DNA/RNA分子的拷貝數或濃度。

圖1 dRCR的實驗流程

圖2 dRCR的泊松分布校正

與第一、二代PCR技術相比，dRCR具有很多優勢：一是特異性、靈敏性均有顯著提高；二是在不依賴內參和標準曲線的前提下，可直接得到絕對量化指標；三是納米微孔反應單元相互獨立、封閉，避免了PCR抑制劑及不同核酸分子擴增產物間的相互干擾，極大的提高了檢測的準確度和可重復性。

二、dRCR在動物疫病防控中的應用

1.核酸標準品定量

核酸標準品是一種已知濃度和純度的核酸分子，可以用于核酸定量、質量控制和實驗標準化等方面，是分子生物學和生物技術研究中非常重要的實驗材料。使用分光光度法測量核酸標準品濃度，容易受到污染核酸或蛋白質和鹽的影響，核酸標準品為質粒時，儲備液的不均勻性或存在沒有靶序列插入的質粒，同樣影響標準品定量的準確性。

dPCR技術在核酸標準品定量方面的優勢在于其高精度和高可靠性。dPCR技術可以準確地計算目標序列的拷貝數，避免了實時熒光定量PCR技術中的測量誤差和擴增效率誤差。因此，dPCR技術可以提供非常精確的核酸標準品定量結果。

2.動物疫病檢測

dPCR技術在動物疫病檢測方面的有廣泛的應用前景，可以檢測各種動物疫病的病原體，例如禽流感、口蹄疫、豬瘟等，其優勢在于其高靈敏度、高特異性和高可靠性。dPCR技術可以檢測樣品中非常低濃度的病原核酸，靈敏度相對于qPCR通常高5-100倍，因此可以在早期發現病例，從而避免疾病的擴散和傳播。

圖3 qPCR梯度檢測：10拷貝以下樣本無法檢出

圖4 dPCR梯度檢測：有效檢出10拷貝以下樣本

3.動物疫病多重檢測

多重PCR技術一次擴增反應即可實現對多種病原體進行檢測，相較單重檢測而言成本顯著降低。但是仍然存在許多影響多重PCR擴增與檢測效果的因素，其中多個靶標擴增效率的一致性是最大的難題，檢測重數越多，效率一致性往往越低。dRCR采用終點熒光檢測和納米微孔分區技術，檢測結果不受擴增效率的影響，能準確定量和避免漏檢。

目前主流品牌的dRCR儀均有多個檢測通道，如羅氏診斷的Digital LightCycler數字PCR儀擁有6個檢測通道，可實現6重病原檢測。下圖應用羅氏dRCR儀同時檢測禽流感H5、H7、H9亞型和新城疫病毒4個病原，各檢測通道間無干擾，定量結果準確性高。

圖5 羅氏Digital LightCycler數字PCR儀多重檢測

4.抗原快速診斷產品的評價

來源不同廠家的抗原快檢試劑，靈敏度差異較大。dPCR可以絕對定量待測樣品中的病原核酸，從而精準的評價抗原檢測試劑的檢測限。

5.動物疫苗研發中的應用

dPCR可對重組腺病毒疫苗等活載體疫苗進行定量，作為生產過程中質量評價、活性滴定、雜質評估的有力工具。同時，dPCR可定量動物血液中微量的病毒，可作為疫苗免疫效果評價的有效工具。

6.動物源性成分檢測

世界各國每年都會有許多肉類摻假事件被曝光，包括將廉價肉摻入高價肉或添加非肉成分冒充肉及肉制品等。dPCR技術可直接對物種特異性DNA的拷貝數進行絕對定量，只需構建物種特異性DNA拷貝數與肉粉重量之間的關系曲線，即可對肉制品含量進行定量。

三、納米微孔芯片數字PCR儀新貴

Digital LightCycler數字PCR儀是羅氏最新推出的高性能產品，充分拓展數字PCR的應用領域。

圖6羅氏Digital LightCycler 數字PCR儀

羅氏Digital LightCycler儀亮點

1.應用靈活：陣列式納米芯片技術，3種密度芯片可更換；

2.多重檢測：6 重熒光多色檢測，便于開發更多的應用；

3.高度自動化：分析系統整合PCR反應、芯片檢測功能；

4.通量高單次檢測 8-96個樣本，適合科研及臨床檢測；

5.時間快：單塊板1.5h, 八塊板滿載則 4h 內完成樣品擴增、分析；

6.5x預混液: 更大的樣品量輸入；

四、結語

dPCR以明顯的技術優勢，已經廣泛應用于核酸檢測的方方面面。dRCR在病原微生物檢測，腫瘤液態活檢，遺傳生殖檢測，公共衛生檢測，環境微生物檢測，RNA表達檢測，NGS文庫定量，甲基化檢測等領域都發揮著越發重要的作用。通過建立完善的dPCR檢測流程，相信dPCR能讓蓬勃發展的分子診斷如虎添翼。